DB22T 2563-2016 甲型H1N1流感病毒核酸检测 Real-time PCR法

摘要：本文件规定了甲型H1N1流感病毒核酸检测的Real-time PCR方法的技术要求、操作步骤和结果判定。本文件适用于医疗机构、疾控中心及相关实验室对甲型H1N1流感病毒的检测与诊断。
Title：Detection of A/H1N1 Influenza Virus by Real-time PCR - Nucleic Acid Testing Method
中国标准分类号：C46
国际标准分类号：11.100

《DB22/T 2563-2016 甲型H1N1流感病毒核酸检测 Real-time PCR法》是一项吉林省地方标准，主要用于指导实验室利用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。以下将选取标准中的关键条款进行详细解读。

**4.1 样品采集**

该部分规定了样品采集的具体要求。首先强调采样应在患者发病初期或急性期进行，以确保样本中含有足够量的病毒核酸。同时，明确了鼻咽拭子、口咽拭子和呼吸道吸取物为常用的采样部位，并且需要使用无菌棉签和专用的病毒保存液。此外，还指出采集后的样品应立即置于4℃条件下保存并在24小时内运送至实验室，若不能及时检测则需冷冻保存。

**4.2 样品处理**

在样品处理环节中，标准指出要先对采集到的样品进行预处理，包括去除杂质及细胞成分等步骤。具体操作时，需将样品加入裂解液中充分混匀后静置一段时间，以便有效释放病毒RNA。之后通过离心分离得到上清液作为后续实验材料。值得注意的是，在整个过程中必须严格遵守无菌操作规程，避免污染。

**4.3 实验试剂与仪器设备**

对于实验所使用的试剂盒及仪器设备也有明确要求。推荐使用经过验证能够特异性识别甲型H1N1流感病毒基因片段的商业试剂盒，并且要求其灵敏度不低于102拷贝数/毫升。此外，PCR仪需具备良好的温度控制性能以及荧光信号检测功能，确保反应过程稳定可靠。

**4.4 反应体系建立**

关于反应体系的构建，标准给出了详细的配方比例。例如，每25微升反应体系中通常包含有10倍浓度缓冲液2.5微升、dNTP混合物0.5微升、正向引物和反向引物各0.2微升、探针0.4微升、酶0.2微升以及模板DNA不超过5微升。另外还特别提到添加一定量的MgCl2可以提高扩增效率。

**4.5 扩增条件设定**

扩增条件是影响结果准确性的重要因素之一。根据本标准建议，预变性步骤设置为95℃持续10分钟；然后进入循环阶段，每个周期包括94℃变性15秒、58℃退火延伸45秒，共40个循环；最后进行熔解曲线分析来确认产物特异性。

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