DB22T 2559-2016 牛新孢子虫病检测方法 LAMP法

摘要：本文件规定了牛新孢子虫病的环介导等温扩增（LAMP）检测方法的技术要求、操作步骤和结果判定。本文件适用于牛新孢子虫病的快速检测与诊断。
Title：Detection Method of Neospora Caninum in Cattle by LAMP
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：11.220

《DB22/T 2559-2016 牛新孢子虫病检测方法 LAMP法》是吉林省地方标准，规定了利用环介导等温扩增技术（LAMP）对牛新孢子虫病进行检测的方法。以下是对该标准中一些重要条文的详细解读。

一、范围

本标准适用于牛新孢子虫病的实验室检测。明确了LAMP法适用于牛新孢子虫病的诊断，为后续具体操作提供了依据。

二、术语和定义

1. 环介导等温扩增（LAMP）：一种基于DNA模板在恒定温度下进行的核酸扩增技术。此定义有助于理解整个检测过程的基本原理。

2. 牛新孢子虫病：由新孢子虫引起的一种人畜共患寄生虫病。明确疾病名称及其特性，便于识别和研究。

三、试剂与材料

1. 模板DNA提取试剂盒：用于从样本中提取高质量的DNA。

2. LAMP反应试剂盒：包含特异性引物、Bst DNA聚合酶等必要成分。确保试剂的质量直接影响检测结果的准确性。

四、仪器设备

1. 实时荧光定量PCR仪：用于监测LAMP反应过程中荧光信号的变化。

2. 恒温金属浴：保持反应温度稳定在63℃±1℃范围内。维持适宜的反应条件对于保证实验成功至关重要。

五、样品采集与保存

1. 血液样本应在无菌条件下采集，并立即置于含有EDTA抗凝剂的试管中。

2. 样品应于-20℃冷冻保存，避免反复冻融导致DNA降解。正确处理样品可以提高检测灵敏度。

六、检测步骤

1. 模板DNA制备：按照试剂盒说明书操作，获得纯净的DNA溶液。

2. LAMP反应体系配置：将各组分按比例混合均匀后加入到反应管内。

3. 反应程序设定：设置循环次数为40次，每次循环包括预变性、退火延伸三个阶段。

4. 结果判定：观察荧光强度变化曲线，若出现S型增长则判断为阳性。

七、质量控制

1. 阳性对照：使用已知阳性样品作为参照物，验证实验的有效性。

2. 阴性对照：使用无DNA污染的水代替样品，排除非特异性扩增的可能性。

3. 重复性测试：同一份样本至少重复三次以上，以评估方法的一致性。

八、注意事项

1. 实验人员需经过专业培训才能上岗操作。

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