DB13T 2404-2016 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

摘要：本文件规定了猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）的实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法，包括样品采集、RNA提取、RT-PCR扩增及结果判定。本文件适用于猪流行性腹泻病毒的实验室检测和诊断。
Title：Detection method of Porcine Epidemic Diarrhea Virus by RT-PCR
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：07.100.30

《DB13/T 2404-2016猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法》是一项地方标准，主要用于指导实验室对猪流行性腹泻病毒（PEDV）的快速检测。以下是标准中一些关键条款的详细解读：

### 范围

该标准规定了使用RT-PCR技术检测猪流行性腹泻病毒的方法。适用于猪场、兽医实验室等场所对PEDV感染的诊断。

### 规范性引用文件

标准中引用了GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法，这是确保实验用水质量的重要依据，直接影响到检测结果的准确性。

### 术语和定义

- **RT-PCR**：即逆转录聚合酶链式反应，是一种将RNA转化为cDNA后进行扩增的技术。

- **阳性对照**：含有已知浓度的PEDV RNA的标准样品，在实验中用于验证试剂盒的有效性和操作步骤的正确性。

- **阴性对照**：不含任何PEDV成分的样品，用于排除非特异性扩增的可能性。

### 原理

RT-PCR基于特定引物与目标序列结合，通过逆转录酶将病毒RNA转录成互补DNA（cDNA），随后利用热循环仪使DNA片段不断复制放大，最终达到可检测水平。

### 实验材料与设备

- **样本采集工具**：无菌棉签或拭子，用于从病猪肠道内容物或粪便中提取样本。

- **核酸提取试剂盒**：用于分离和纯化样本中的RNA。

- **RT-PCR试剂盒**：包含所有必要的化学物质如缓冲液、酶、引物及探针。

### 样品处理

采集新鲜样本后立即置于低温环境中保存直至送至实验室。在实验室里，按照说明书要求加入适当的裂解液以破坏细胞结构释放出RNA，并去除杂质。

### RT-PCR反应体系建立

根据试剂盒说明书配置好反应混合物，包括模板RNA、正向引物、反向引物以及荧光标记探针等组分。然后加入适量的反转录酶和DNA聚合酶开始反应。

### 结果判断

若Ct值小于设定阈值且扩增曲线呈典型S形，则判定为阳性；如果Ct值大于阈值或者没有明显的扩增信号，则视为阴性。同时需注意设置合适的内参基因来校正样本间差异。

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