DB65T 3899-2016 高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测方法

摘要：本文件规定了高致病性猪蓝耳病病毒的RT-PCR检测方法，包括样品采集、核酸提取、RT-PCR反应体系及条件、结果分析等内容。本文件适用于高致病性猪蓝耳病的实验室检测和诊断。
Title：Detection Method of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus by RT-PCR
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：11.220

《DB65/T 3899-2016高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测方法》是一项重要的地方标准，主要用于规范高致病性猪蓝耳病的实验室检测流程。以下是对该标准中一些关键条款的详细解读。

### 样品采集与处理

标准指出，样品应从疑似感染动物的耳静脉、鼻腔或咽喉拭子中采集。样品采集后需立即置于含有RNA稳定剂的采样管中，并在4℃条件下保存不超过24小时，或在-70℃长期保存。这一要求确保了样本中的RNA不会降解，从而保证检测结果的准确性。

### 核酸提取

核酸提取是RT-PCR检测的重要步骤。标准推荐使用商品化的RNA提取试剂盒，按照说明书操作。特别强调在提取过程中要避免RNase污染，确保操作环境清洁无菌。此外，对于每批次实验都应设置阴性和阳性对照，以验证提取效率及后续反应体系的有效性。

### 反应体系建立

RT-PCR反应体系的建立需严格按照试剂盒说明书进行配置。标准特别提到引物设计时应避开基因组内可能存在的重复序列区域，以提高特异性。同时，反应体系中各成分浓度需精确控制，如逆转录酶、DNA聚合酶等关键酶的添加量直接影响最终扩增效果。

### 扩增条件设定

标准规定了RT-PCR扩增的具体条件：首先进行42℃下15分钟的逆转录反应，随后94℃预变性5分钟；接着进入循环阶段，包括94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；最后72℃延伸7分钟结束反应。这些条件的选择基于病毒基因片段的特点，旨在获得最佳扩增效果。

### 结果分析

检测结果通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。标准要求将扩增产物与已知大小的标准品在同一块胶上电泳比较，观察是否有对应目的条带出现。若仅在预期位置出现单一清晰条带，则判定为阳性；否则为阴性。值得注意的是，所有阳性结果均需通过测序进一步确认。

### 质量控制

在整个检测过程中，质量控制贯穿始终。除了上述提到的阴阳性对照外，还需定期对仪器设备进行校准维护，确保其处于良好工作状态。同时，实验室应建立完善的记录制度，详细记载每次实验的条件、参数以及结果，便于追溯和复核。

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