DB22T 2081-2014 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR方法

摘要：本文件规定了鼠疫耶尔森菌核酸测定的荧光PCR方法的技术要求、操作步骤和结果判定。本文件适用于鼠疫耶尔森菌的核酸检测，可用于疾病防控、公共卫生监测及相关研究领域。
Title：Determination of Yersinia Pestis Nucleic Acid by Fluorescent PCR Method
中国标准分类号：C46
国际标准分类号：11.020

鼠疫耶尔森菌是一种高致病性病原体，其核酸检测对于疾病诊断和疫情防控具有重要意义。DB22/T 2081-2014《鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR方法》为实验室检测提供了标准化的技术依据。以下将对标准中几个关键条文进行详细解读。

首先，在样品采集与处理部分，标准要求采集样本时应确保无菌操作，并迅速将样本置于特定保存液中以防止核酸降解。这一环节直接关系到后续检测结果的准确性，因此必须严格按照规定执行。

其次，关于试剂盒的选择与使用，标准指出所使用的荧光定量PCR试剂盒需经过国家认证并符合相关性能指标。在实际操作过程中，需要仔细阅读说明书，确保所有试剂均在有效期内且储存条件正确。此外，还应对试剂盒进行必要的性能验证，包括灵敏度、特异性和重复性等指标的测试。

第三，在荧光PCR反应体系建立方面，标准明确了反应体系的组成成分及其浓度要求。例如，DNA模板量一般控制在10-50 ng之间，引物终浓度通常设定为0.2-0.4 μmol/L。这些参数的选择直接影响扩增效率及检测结果的可靠性。

第四，对于扩增程序的设计，标准给出了推荐的退火温度范围以及循环次数建议。具体而言，退火温度可根据引物序列计算得出，一般介于55℃至65℃之间；而循环数则根据目标基因片段长度适当调整，通常设置为35-45个循环。值得注意的是，在优化实验条件下还需考虑熔解曲线分析来判断产物单一性。

最后，在结果判读环节，标准强调了阳性对照、阴性对照以及空白对照的重要性。只有当阳性对照呈现预期信号而阴性对照未检出任何信号时，才能认为本次检测有效。同时，还需结合Ct值大小与内参基因表达水平综合评估样品中是否存在目标序列。

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