DB22T 2083-2014 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP法

DB22/T 2083-2014是吉林省地方标准，规定了利用随机扩增多态DNA技术（RAMP）对食用菌菌种真实性进行鉴定的方法。以下选取标准中的关键条款进行详细解读。

5.1 菌种准备

应选用处于生长旺盛期的食用菌纯培养物作为待测样品。确保菌种新鲜且无污染，通常是在适宜温度下培养7-10天后的子实体或菌丝体。这一步骤非常重要，因为只有健康的菌种才能提供可靠的DNA模板。

5.2 DNA提取

采用改良CTAB法提取总DNA。具体步骤包括：将菌丝体研磨成粉后加入裂解液，65℃水浴1小时，然后加入氯仿-异戊醇混合液抽提，最后用无水乙醇沉淀DNA。需要注意的是，提取过程中要避免RNA污染，并且DNA浓度应在50ng/μL以上。

6.1 引物设计

引物序列由随机序列和特异性序列组成，其中随机序列长度为8-12bp，特异性序列长度为15-20bp。设计时需考虑GC含量、自我互补性及与其他引物间的交叉反应等因素。例如，对于某食用菌属，可以设计如下引物：

随机序列：ACGTTGCCAG

特异性序列：GGCTACGATC

6.2 PCR扩增

反应体系包含10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA和去离子水。反应条件一般为94℃预变性5分钟；随后35个循环，每个循环包括94℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；最后72℃终延伸10分钟。扩增产物应立即进行检测，不宜长时间保存。

7.1 电泳检测

将PCR产物与loading buffer混合后，在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳。电压设置为80-100V，时间约为40-60分钟。通过紫外灯观察并记录电泳结果。不同食用菌种类间应显示出明显的多态性差异。

8 结果判定

根据电泳图谱判断待测菌种是否与已知标准菌株一致。如果待测菌种的DNA指纹图谱与标准菌株完全相同，则可判定为同一品种；若有显著差异，则认为不是同一品种。同时，还应结合其他鉴定方法进行综合分析。

总之，本标准提供了基于RAMP技术的食用菌菌种真实性鉴定的具体操作流程和技术要求，有助于保障食用菌产业的健康发展。