DB22T 2053-2014 饲料中构巢曲霉测定 实时荧光PCR方法

摘要：本文件规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光PCR检测方法的技术要求、试剂与材料、仪器设备、样品处理及检测步骤。本文件适用于饲料及其原料中构巢曲霉的定性检测。
Title：Feed - Determination of Aspergillus nidulans - Real-time fluorescence PCR method
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：67.040

DB22/T 2053-2014是吉林省地方标准，规定了饲料中构巢曲霉采用实时荧光PCR方法的检测步骤。以下是对该标准中重要条文的详细解读：

标准中明确指出，实时荧光PCR反应体系应包括特异性引物和探针。其中，引物浓度为每升含0.2至1微摩尔，探针浓度为每升含0.1至0.2微摩尔。这意味着在配置反应体系时，需要精确控制引物与探针的浓度，以确保检测的灵敏度和特异性。

关于样本处理部分，标准要求将饲料样品粉碎并过筛，确保粒径不超过1毫米。这一步骤至关重要，因为样本的均一性直接影响到后续核酸提取的质量。同时，样本需在-20℃条件下保存，避免因温度变化导致的样本降解。

在核酸提取环节，标准推荐使用商品化的DNA提取试剂盒。提取后的DNA浓度应达到50至100纳克/微升，并且A260/A280比值应在1.8至2.0之间。这一范围内的比值表明提取的DNA纯度较高，适合用于实时荧光PCR检测。

对于实时荧光PCR扩增条件，标准给出了详细的参数设置：预变性95℃持续10分钟；随后进行40个循环，每个循环包括95℃变性15秒，55℃退火30秒以及72℃延伸30秒。最后还需进行溶解曲线分析，以验证扩增产物的特异性。

当扩增完成后，若Ct值小于等于35，则判定为阳性；若Ct值大于35但小于40，则需重复实验确认结果；如果重复实验仍显示Ct值大于35且小于40，则判定为可疑阳性；而Ct值大于等于40则判定为阴性。这些判断标准为检测人员提供了明确的操作指南，有助于提高检测结果的准确性。

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