TCVMA 131-2023 绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光PCR检测方法

本文将聚焦于TCVMA 131-2023与旧版标准中关于内源性对照设置这一关键差异展开深入分析。在旧版标准中，仅要求使用外源性内标来监控反应抑制情况，但新版标准明确指出，在检测绵羊肺炎支原体时需同时采用内源性和外源性两种内标。

内源性内标的选择至关重要，它应为宿主基因组DNA中的单拷贝序列。具体操作时，首先从待检样本中提取总DNA，确保提取效率符合要求。接着设计一对特异性引物及探针靶向该内源性基因，其中探针需标记报告基团与淬灭基团。在反应体系中加入适量的内源性引物和探针后，按照优化好的扩增程序进行反应。

通过这样的设置，可以有效避免因样本质量不佳或抑制物存在而导致的假阴性结果。例如，在实际应用过程中，若发现内源性内标未被成功扩增，则表明样本提取存在问题或存在强抑制物，此时需重新处理样本并重复检测。这种双重内标策略显著提升了检测结果的可靠性，尤其对于临床诊断具有重要意义。