TSDVMA 003-2024 鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的双重PCR方法

摘要：本文件规定了鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的双重PCR方法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤、结果分析及质量控制。本文件适用于动物疫病防控中多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的快速鉴别检测。
Title：Dual PCR Method for Differentiation of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：07.100.99

在TSDVMA 003-2024《鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的双重PCR方法》中，有一项重要的更新是明确了内参基因的选择和使用方法。这一改动对于确保检测结果的准确性具有重要意义。

在旧版标准中，并未明确规定内参基因的具体类型及作用机制，这可能导致不同实验室间的结果可比性较差。新版标准明确指出，在进行双重PCR时，应选择β-肌动蛋白（ACTB）作为内参基因。此基因广泛存在于哺乳动物细胞中且表达稳定，能够有效监控反应体系的效率以及样本质量。

具体应用时，首先需要设计一对特异性引物用于扩增目标病原体DNA序列，同时设计另一对引物专门针对ACTB基因区域。在实验操作过程中，将待测样品与已知阳性对照、阴性对照一同加入到PCR反应体系中。通过对比目标病原体与内参基因的Ct值，可以评估样本中是否存在抑制因素或者核酸提取是否充分。

例如，在检测过程中如果发现目标病原体Ct值较高而ACTB Ct值正常，则可能意味着样本中含有抑制剂；反之，若ACTB未能扩增成功，则需重新检查样本准备步骤。这种双重监测机制不仅提高了检测结果的可靠性，还增强了不同批次间数据的一致性，为临床诊断提供了更加准确的信息支持。