DB12T 1271-2023 有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法

DB12/T 1271-2023《有机肥中活性大肠杆菌快速测定 PMA-qPCR法》是一项重要的地方标准，旨在通过荧光定量PCR技术结合PMA（阳性菌膜穿透剂）预处理，快速检测有机肥料中的活性大肠杆菌。这项标准为确保有机肥的质量安全提供了科学依据。以下将对标准中的关键内容进行详细解读。

样品采集与制备

标准明确指出样品的采集需具有代表性，通常从生产线上随机抽取或从成品堆中均匀取样。样品采集后应迅速运输至实验室，并在4℃条件下保存不超过24小时。对于样品的制备，要求使用无菌操作工具将样品充分混匀，然后称取1g样品加入含有9ml无菌生理盐水的试管中，振荡混匀后静置10分钟，取上清液作为检测样本。

PMA预处理

为了区分死菌和活菌，标准采用了PMA预处理步骤。具体操作是将上述制备好的样品溶液稀释至适当浓度后，加入终浓度为50μM的PMA溶液，避光孵育5分钟后，再通过蓝光照射（波长465-480nm）处理20分钟。此过程能够使PMA渗透到破损细胞膜的死菌中，与DNA结合，从而阻止其在后续qPCR反应中的扩增，仅保留活菌信号。

qPCR反应体系建立

标准规定了qPCR反应体系的组成及条件。反应体系包括特异性引物、探针、模板DNA以及SYBR Green I染料等成分。反应条件设定为：95℃预变性3分钟；随后进行40个循环的95℃变性15秒，60℃退火延伸60秒。每个样品设置三个重复孔以保证结果可靠性。

结果分析与判定

根据Ct值判断是否存在目标基因。当样品的Ct值小于等于设定阈值时，则判定该样品中含有活性大肠杆菌；反之则认为未检出。同时，还需绘制标准曲线来评估方法灵敏度，并通过阴性和阳性对照验证实验的有效性。

注意事项

执行过程中需要注意以下几点：

1. 所有实验器材均需提前灭菌处理；

2. 操作人员必须穿戴防护服并严格遵守无菌操作规程；

3. 实验室环境应保持清洁卫生，避免交叉污染；

4. 若发现异常情况应及时查找原因并采取相应措施。

总之，《有机肥中活性大肠杆菌快速测定 PMA-qPCR法》不仅规范了检测流程，还强调了各个环节的重要性，有助于提高检测准确性和效率，保障有机肥料的安全使用。