DB65T 4669-2023 小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法

DB65/T 4669-2023标准规定了一种用于同时检测小反刍兽疫病毒和羊传染性脓疱病毒的双重实时荧光定量PCR检测方法。以下是对该标准中一些关键条款的详细解读。

试剂与材料

标准要求使用特异性引物和探针。对于小反刍兽疫病毒，正向引物序列为5'-GACGGTGCTATCGTTCTTGA-3'，反向引物为5'-AGGTGCCAATGAGATTGACA-3'，FAM标记的探针序列为5'-FAM-TTTGGACGTGACAGCAG-BHQ1-3'。而对于羊传染性脓疱病毒，正向引物为5'-TGCTGAGAATGCTTGATGTC-3'，反向引物为5'-CTTGAGGACATCGTTGTTGC-3'，HEX标记的探针为5'-HEX-ACATGCGCCTTCAAGA-BHQ2-3'。这些引物和探针的设计确保了对目标病毒的高度特异性。

样品采集与处理

样品应从疑似感染动物采集，包括鼻拭子、眼拭子、口腔拭子等。采集后立即置于含有RNA稳定剂的保存液中，并在低温条件下运输至实验室。样品处理时需使用无RNase的耗材，并通过机械或化学方法裂解细胞以释放病毒核酸。

实验条件

反应体系总体积为20μL，其中包含10μL 2×One Step RT-PCR Mix、各0.4μL正向引物（10μM）、0.4μL反向引物（10μM）、0.2μL探针（10μM）、4μL RNA模板以及补足体积的双蒸水。反应程序设定为：50℃反转录30分钟；95℃预变性10分钟；随后进行40个循环的95℃变性15秒，60℃退火延伸60秒。

结果判定

当Ct值小于或等于38且扩增曲线呈典型S型时可判定为阳性。如果Ct值大于38但小于40，则需要重复实验确认。阴性对照组不得出现扩增信号，阳性对照组则必须有明确的扩增结果。

以上内容基于DB65/T 4669-2023标准中的核心部分进行了提炼与说明，旨在帮助理解和执行该标准。