DB34T 4198-2022 梨黑斑病菌的LAMP检测方法

摘要：本文件规定了梨黑斑病菌(Losnegemium pyricola)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的原理、试剂与材料、仪器设备、样品处理、核酸提取、LAMP反应体系和条件、结果分析及检测报告。本文件适用于梨黑斑病菌的快速检测，可应用于田间监测、检疫鉴定及科学研究。
Title：Detection method of pear black spot fungus by LAMP
中国标准分类号：B 61
国际标准分类号：65.020.20

DB34/T 4198-2022《梨黑斑病菌的环介导等温扩增（LAMP）检测方法》是一项安徽省地方标准，旨在为梨黑斑病菌的快速检测提供科学依据。该标准规定了利用LAMP技术对梨黑斑病菌进行检测的具体操作流程和判定准则。以下将选取标准中的重要条文进行详细解读。

### 术语和定义

标准中首先明确了“梨黑斑病菌”这一术语，指引起梨树叶片、果实出现黑褐色斑点的真菌病原体。这一定义确保了检测对象的明确性，避免因概念模糊导致误判。

### 原理

LAMP技术基于特异性引物在恒温条件下对目标DNA序列进行高效扩增。标准指出，通过设计六条特异性引物分别靶向目标基因的不同区域，能够在60-65℃的温度下快速完成扩增反应。这种方法无需复杂的仪器设备，适合现场快速检测。

### 样品采集与处理

样品采集需遵循无菌操作原则，从疑似感染部位采集新鲜组织样本。样本处理包括表面消毒和研磨成匀浆状，以保证后续提取DNA的质量。标准强调了样本保存条件，应在低温环境下短期存放，以免影响检测结果。

### DNA提取

使用商业化试剂盒或自制试剂提取样本DNA。标准要求提取的DNA应满足浓度≥10ng/μl且纯度A260/A280值在1.8-2.0之间。高质量的DNA是保证检测准确性的基础。

### LAMP反应体系

标准推荐使用25μL反应体积，包含模板DNA、特异性引物、Bst DNA聚合酶等成分。反应条件设定为63℃恒温下持续60分钟。在此过程中，反应液颜色变化可作为初步判断依据：若呈现绿色则为阳性，紫色则为阴性。

### 结果判定

最终结果需结合肉眼观察和荧光检测仪读取数据综合判断。当肉眼可见明显颜色变化，并且荧光信号强度达到设定阈值时，判定为阳性；反之，则为阴性。此外，标准还特别提到，对于可疑结果应重复实验以确认。

### 注意事项

为了确保检测结果的有效性和可靠性，标准提出了多项注意事项。例如，在整个操作过程中必须严格遵守无菌操作规程；不同批次的试剂应分开存放并标明日期；定期校准仪器设备等。

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