DB33T 2405-2021 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法

DB33/T 2405-2021是一项关于猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）双重荧光RT-PCR检测方法的地方标准。该标准适用于从病料中快速检测这两种病毒，为防控猪群的腹泻疾病提供技术支持。

关键条款解读如下：

1. 样品采集：标准要求采集病猪的肠道样本，包括空肠、回肠或十二指肠等部位的新鲜组织。样品应立即置于无RNA酶的保存液中并迅速送检，确保样本的新鲜度和完整性。

2. 核酸提取：采用商业化试剂盒提取总RNA，需严格遵守操作规程以避免RNA降解。提取后的RNA浓度和纯度需通过紫外分光光度计测定，确保后续实验的质量。

3. 引物与探针设计：针对PDCoV和PEDV分别设计特异性引物和荧光探针。引物长度一般在18-25个碱基之间，GC含量控制在40%-60%范围内，熔解温度(Tm)应在55-65℃之间。探针应标记荧光报告基团和淬灭基团，并保持良好的特异性和灵敏度。

4. 反应体系建立：反应总体积通常为20μL，包含逆转录酶、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、引物、探针以及模板RNA。各成分浓度需经过优化，以获得最佳扩增效果。

5. 扩增条件设定：逆转录步骤温度一般设置为50℃持续15分钟；预变性95℃持续10分钟；随后进行40个循环的两步法扩增，即95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟。

6. 结果判定：Ct值小于阈值判定为阳性，大于阈值且扩增曲线无明显上升趋势判定为阴性。当Ct值处于临界范围时需重复试验验证结果。

7. 质量控制：每批次检测需设立阳性对照、阴性对照及空白对照，确保实验结果准确可靠。同时定期对仪器设备进行校准维护，保证检测系统的稳定性。

8. 安全防护：实验过程中必须严格遵守生物安全规范，使用一次性耗材防止交叉污染，废弃物需按相关规定妥善处理。

该标准通过规范化的操作流程和技术参数，提高了PDCoV和PEDV的检测效率和准确性，对于保障生猪健康具有重要意义。