DB33T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法

摘要：本文件规定了鸭坦布苏病毒的RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法的原理、试剂与材料、仪器设备、样品处理、核酸提取、扩增反应、结果分析及注意事项。本文件适用于鸭坦布苏病毒感染的实验室诊断和监测。
Title：Detection method of duck Tembusu virus by RT-PCR and real-time fluorescence quantitative RT-PCR
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：11.220

DB33/T 2247-2020《鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法》是一项浙江省地方标准，规定了用于检测鸭坦布苏病毒的两种RT-PCR技术。以下是对该标准中一些重要条文的详细解读：

### 样品采集与保存

标准指出样品应从疑似感染鸭只的泄殖腔、喉头等部位采集。样品需立即置于含有RNA稳定剂的采样管中，并在-80℃条件下长期保存。这一要求确保了病毒RNA的完整性，避免因样本降解导致检测结果不准确。

### 样品处理

样品处理部分强调使用无RNA酶的耗材和试剂。样品经过匀浆后，需离心去除杂质，上清液用于后续核酸提取。这一步骤对于防止外源性RNA污染至关重要。

### 核酸提取

采用商品化的RNA提取试剂盒进行核酸提取，严格按照说明书操作。提取后的RNA应在-80℃短期储存或立即用于RT-PCR反应。高质量的核酸提取是获得可靠检测结果的基础。

### 引物与探针设计

引物和探针的设计依据鸭坦布苏病毒特异性基因序列。内标引物和探针用于监控整个RT-PCR过程的有效性。合理设计的引物和探针能够提高检测灵敏度和特异性。

### RT-PCR反应体系

反应体系包括逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、引物、探针以及模板RNA。反应条件如退火温度、延伸时间等需根据具体试剂盒说明书优化。建立标准化的反应体系有助于保证检测结果的一致性和可重复性。

### 实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR通过荧光信号监测扩增产物量的变化。Ct值用于判断样品是否阳性。标准建议设置阴性对照、阳性对照及空白对照以验证实验的有效性。

### 结果判定

若样品Ct值小于等于阈值且内标正常，则判定为阳性；反之则为阴性。对于灰区结果（介于阈值附近），需重复试验或进一步确认。

### 质量控制

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