DB22T 3091-2019 鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

摘要：本文件规定了鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法的原理、试剂与材料、仪器设备、样品处理、检测步骤、结果判定和检测报告。本文件适用于鹿结核病病原菌的检测与诊断。
Title：Real-time Fluorescent PCR Method for Detection of Mycobacterium Bovis in Deer
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：07.100.99

DB22/T 3091-2019《鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法》是一项专门用于鹿结核病诊断的行业标准。以下对部分关键条款进行详细解读。

### 样品采集与保存

标准要求采集鹿的鼻腔拭子、口咽拭子或淋巴结组织作为检测样本。采集后应立即置于含有RNA稳定剂的采样管中，并在4℃条件下保存不超过7天，或者在-80℃长期保存。这一规定旨在保证样品中的RNA完整性，避免因保存不当导致假阴性结果。

### 核酸提取

核酸提取需使用商品化的试剂盒按照说明书操作。特别强调提取过程中要严格防止RNase污染，确保提取效率达到90%以上。这是因为RNA容易降解，任何杂质都会影响后续反应的准确性。

### 引物和探针设计

引物和探针的设计基于Mycobacterium tuberculosis复合群特异性IS6110序列。引物长度应在18-25bp之间，GC含量控制在40%-60%，并且熔解温度(Tm)差异不超过1℃。探针则采用TAMRA标记，确保其具有良好的特异性和灵敏度。

### 反应体系与条件

反应体系包括2×Taqman Master Mix、正向引物、反向引物、探针以及模板DNA。总反应体积为20μL。扩增程序设定为：95℃预变性10分钟；随后进行40个循环的95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟。这些参数经过优化可以有效区分目标基因与非特异性扩增产物。

### 结果判定

当Ct值≤35时判定为阳性；Ct值>35且<40时需重复实验；若重复后仍为35

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