DB22T 3091-2019 鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

DB22/T 3091-2019《鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法》是一项专门用于鹿结核病诊断的行业标准。以下对部分关键条款进行详细解读。

样品采集与保存

标准要求采集鹿的鼻腔拭子、口咽拭子或淋巴结组织作为检测样本。采集后应立即置于含有RNA稳定剂的采样管中，并在4℃条件下保存不超过7天，或者在-80℃长期保存。这一规定旨在保证样品中的RNA完整性，避免因保存不当导致假阴性结果。

核酸提取

核酸提取需使用商品化的试剂盒按照说明书操作。特别强调提取过程中要严格防止RNase污染，确保提取效率达到90%以上。这是因为RNA容易降解，任何杂质都会影响后续反应的准确性。

引物和探针设计

引物和探针的设计基于Mycobacterium tuberculosis复合群特异性IS6110序列。引物长度应在18-25bp之间，GC含量控制在40%-60%，并且熔解温度(Tm)差异不超过1℃。探针则采用TAMRA标记，确保其具有良好的特异性和灵敏度。

反应体系与条件

反应体系包括2×Taqman Master Mix、正向引物、反向引物、探针以及模板DNA。总反应体积为20μL。扩增程序设定为：95℃预变性10分钟；随后进行40个循环的95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟。这些参数经过优化可以有效区分目标基因与非特异性扩增产物。

结果判定

当Ct值≤35时判定为阳性；Ct值>35且<40时需重复实验；若重复后仍为35

通过以上解读可以看出，该标准从样本处理到最终结果判断都制定了详尽的操作规范，目的是为了提高检测的准确性和可靠性，从而更好地服务于鹿结核病的防控工作。