DB34T 2997-2017 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程

摘要：本文件规定了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验的样品采集、处理、培养、鉴定及PCR检测方法。本文件适用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的实验室诊断和监测。
Title：Operational Procedures for the Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in Swine
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：11.220

《DB34/T 2997-2017猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程》是安徽省地方标准，规定了检测猪传染性胸膜肺炎病原——放线杆菌的方法。以下是对该标准中一些关键条文的详细解读。

一、样本采集与保存

标准指出，采集样本时应选择病猪的鼻腔分泌物、气管和支气管渗出液以及肺组织等部位。样本应在无菌条件下收集，并立即置于含有冰块的保温箱内送检。若不能及时检测，样本需在-70℃条件下冷冻保存不超过6个月。这一要求确保了样本的新鲜度和完整性，为后续实验提供可靠依据。

二、细菌分离培养

将采集到的样本接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSAYE）平板上，在37℃恒温培养箱中培养24至48小时。标准特别强调，TSAYE平板需提前加入万古霉素和萘啶酸抑制其他杂菌生长。观察到典型菌落特征后，需进一步通过革兰氏染色确认其为革兰氏阴性小球杆状或短丝状细菌。这一步骤对于准确鉴定病原至关重要。

三、生化特性鉴定

经初步分离得到疑似菌株后，需进行一系列生化试验以进一步验证。包括但不限于氧化酶试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、明胶液化试验阳性及尿素酶试验阴性等。这些特征有助于区分不同种类的放线杆菌，提高诊断准确性。

四、分子生物学检测

采用PCR技术扩增特异性基因片段。引物序列设计基于已知的放线杆菌保守区域，能够特异性识别目标病原DNA。反应体系包括模板DNA、上下游引物、Taq酶及缓冲液等成分。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，出现预期大小条带即可判定为阳性结果。这种方法灵敏度高、特异性强，尤其适用于早期感染阶段的快速筛查。

五、结果判断与报告

最终结果需综合考虑以上各项检测指标得出结论。当细菌培养分离成功且具备典型生化特性，同时分子生物学检测呈阳性时，则可确诊为猪传染性胸膜肺炎病例。出具正式报告时，应包含采样信息、检测过程概述、具体结果描述及建议处理措施等内容，以便养殖场采取相应防控手段。

六、注意事项

整个检测流程必须严格遵守生物安全规范，防止交叉污染。所有接触过样本的器材均需彻底消毒灭菌后再使用。此外，定期对仪器设备进行校准维护也是保证检测质量的重要环节之一。

综上所述，《DB34/T 2997-2017猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程》从样本采集到最终报告形成全过程都给出了明确指导，为有效控制该疾病传播提供了科学依据和技术支持。