DB37T 3624-2019 牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测技术规程

DB37/T 3624-2019是山东省地方标准，规定了牛场气溶胶中结核分枝杆菌复合群的荧光定量PCR检测方法。以下是一些关键条款的详细解读：

5.1 样品采集

样品应从牛场环境空气、牛舍空气以及疑似病牛呼出气体中采集。采样点需覆盖牛场主要活动区域，确保代表性。采样高度一般为地面以上1.5米处。

5.2 样品处理

采集到的气溶胶样品需立即进行预处理。首先使用滤膜过滤器收集气溶胶颗粒，然后将滤膜放入含有裂解液的离心管中，超声波震荡30分钟使细菌细胞壁破裂。

5.3 核酸提取

采用商品化的DNA提取试剂盒提取核酸。提取过程需严格按照说明书操作，特别注意加入蛋白酶K以提高提取效率。提取后的核酸溶液需保存在-20℃冰箱中备用。

5.4 荧光定量PCR反应体系

反应总体积为20μL，包含10μL荧光定量PCR预混液、2μL模板DNA、各0.5μL正向引物和反向引物（浓度为10μM）、0.5μL探针（浓度为10μM）以及6.5μL无核酸水。

5.5 扩增程序

设置初始变性95℃ 10分钟，随后进行40个循环的变性95℃ 15秒，退火/延伸60℃ 1分钟。每个循环结束后记录荧光信号。

5.6 结果判定

Ct值小于或等于38时判为阳性；Ct值大于38且小于40时需重复实验；Ct值大于或等于40时判为阴性。同时设立阳性和阴性对照组，确保实验结果可靠。

这些条款明确了整个检测流程的关键步骤和技术要求，对于规范牛场结核病防控具有重要意义。