DB34T 3283-2018 副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法

摘要：本文件规定了副猪嗜血杆菌的分子分型多 locus 序列分型（MLST）方法的技术要求，包括样本准备、PCR扩增、测序及数据分析等内容。本文件适用于副猪嗜血杆菌的分子分型研究及流行病学调查。
Title：Molecular Typing of Haemophilus parasuis by MLST Method
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：11.100.99

DB34/T 3283-2018 是安徽省地方标准，规定了利用多位点序列分型（MLST）技术对副猪嗜血杆菌进行分子分型的方法。以下是对该标准中重要条文的详细解读。

### 范围

标准适用于从猪体分离出的副猪嗜血杆菌菌株的多位点序列分型。这为研究副猪嗜血杆菌的遗传多样性和流行病学提供了科学依据。

### 规范性引用文件

标准引用了GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》等文件。这些基础规范确保了实验用水的质量，从而保证检测结果的准确性。

### 术语和定义

- **多位点序列分型**：通过扩增并测序多个管家基因片段，比较不同菌株间的差异来实现分型。

- **管家基因**：在不同生物体中保守且表达水平稳定的基因，用于构建系统发育树。

### 技术要求

#### 样品采集与处理

样品应来源于疑似感染副猪嗜血杆菌的病猪，采集部位包括鼻腔、咽喉或肺部组织。样本需立即置于无菌生理盐水中送检，并尽快进行DNA提取。

#### DNA提取

使用商业化试剂盒按照说明书操作，确保提取的DNA纯度高、浓度适中。良好的DNA质量是后续PCR反应成功的关键。

#### 引物设计

根据已知的副猪嗜血杆菌全基因组信息，选择7个管家基因作为靶标，设计特异性引物。这些基因包括adk、fumC、glnA、glpF、pgm、rpoB 和 thrA。

#### PCR扩增

采用常规PCR体系，每个管家基因单独扩增。反应条件为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

#### 测序与数据分析

扩增产物送至专业机构测序，获得序列后登录到公共数据库比对，确定其等位基因编号。利用软件如BioNumerics构建MLST图谱，评估菌株间的亲缘关系。

### 结果报告

报告内容应包括但不限于以下几点：

- 菌株基本信息（如采样地点、时间）

- 每个管家基因的等位基因编号

- ST型别（Sequence Type）

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