DB34T 3283-2018 副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法

DB34/T 3283-2018 是安徽省地方标准，规定了利用多位点序列分型（MLST）技术对副猪嗜血杆菌进行分子分型的方法。以下是对该标准中重要条文的详细解读。

范围

标准适用于从猪体分离出的副猪嗜血杆菌菌株的多位点序列分型。这为研究副猪嗜血杆菌的遗传多样性和流行病学提供了科学依据。

规范性引用文件

标准引用了GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》等文件。这些基础规范确保了实验用水的质量，从而保证检测结果的准确性。

术语和定义

- 多位点序列分型：通过扩增并测序多个管家基因片段，比较不同菌株间的差异来实现分型。

- 管家基因：在不同生物体中保守且表达水平稳定的基因，用于构建系统发育树。

技术要求

# 样品采集与处理

样品应来源于疑似感染副猪嗜血杆菌的病猪，采集部位包括鼻腔、咽喉或肺部组织。样本需立即置于无菌生理盐水中送检，并尽快进行DNA提取。

# DNA提取

使用商业化试剂盒按照说明书操作，确保提取的DNA纯度高、浓度适中。良好的DNA质量是后续PCR反应成功的关键。

# 引物设计

根据已知的副猪嗜血杆菌全基因组信息，选择7个管家基因作为靶标，设计特异性引物。这些基因包括adk、fumC、glnA、glpF、pgm、rpoB 和 thrA。

# PCR扩增

采用常规PCR体系，每个管家基因单独扩增。反应条件为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

# 测序与数据分析

扩增产物送至专业机构测序，获得序列后登录到公共数据库比对，确定其等位基因编号。利用软件如BioNumerics构建MLST图谱，评估菌株间的亲缘关系。

结果报告

报告内容应包括但不限于以下几点：

- 菌株基本信息（如采样地点、时间）

- 每个管家基因的等位基因编号

- ST型别（Sequence Type）

- 系统发育位置描述

注意事项

在实际操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免污染。同时注意保存好所有原始记录，以便追溯检查。

以上就是关于DB34/T 3283-2018标准中关于副猪嗜血杆菌MLST方法的重要条文解读。该标准为标准化地开展副猪嗜血杆菌的研究工作提供了可靠的技术支持。