DB22T 2988-2019 白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP法

摘要：本文件规定了采用ITS-RFLP法对白灵菇和杏鲍菇菌种进行真实性鉴定的方法和技术要求。本文件适用于白灵菇和杏鲍菇菌种的生产、检测及质量控制。
Title：Identification of authenticity of Pleurotus nebrodensis and Pleurotus eryngii strains by ITS-RFLP method
中国标准分类号：B 46
国际标准分类号：67.080

DB22/T 2988-2019《白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP法》是一项专门用于鉴定白灵菇和杏鲍菇菌种真实性的标准。这项标准通过内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）的限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）技术来实现菌种的精确鉴定。

### 关键条文解读

#### 4.1 菌种样本采集与保存

标准中规定了菌种样本的采集应在菌丝体生长旺盛时期进行，采集部位应为菌丝体的边缘部分，确保样本具有代表性。样本采集后需立即置于无菌条件下，并采用冷冻或冷藏方式进行短期保存，以保持其活性。

#### 5.1 DNA提取

DNA提取是整个鉴定过程的关键步骤之一。标准要求使用适合真菌DNA提取的方法，如CTAB法或试剂盒法，确保提取的DNA纯度高、浓度适中。同时，提取后的DNA应通过紫外分光光度计检测其纯度和浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。

#### 6.1 PCR扩增

PCR扩增区域为ITS1-5.8S-ITS2序列。标准建议使用通用引物对进行扩增，如ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') 和 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')。反应体系需优化，包括模板DNA量、引物浓度、dNTPs及缓冲液等成分的比例。扩增程序通常包括预变性、变性、退火和延伸四个阶段。

#### 7.1 酶切反应

在获得目标DNA片段后，选择合适的限制性内切酶进行酶切。标准推荐使用如HaeIII、HinfI等常见酶种，这些酶能够产生清晰可辨的RFLP图谱。酶切反应需严格按照酶说明书操作，控制好温度和时间参数。

#### 8.1 结果分析

酶切产物通过凝胶电泳分离后，利用成像系统记录图像。结果分析时，需将待测样品与已知标准品进行比较，根据片段大小差异判断菌种的真实性。当出现不确定情况时，可重复实验或结合其他分子生物学方法进一步确认。

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