DB42T 790-2012 甲型H1N1流感病毒双抗体ELISA检测方法

《DB42/T 790-2012 甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法》是一项湖北省地方标准，该标准详细规定了利用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测甲型H1N1流感病毒的原理、试剂与材料、仪器设备、样品采集与保存、实验步骤、结果判定及质量控制等内容。以下将对标准中的关键内容进行深入解析。

原理

该方法基于双抗体夹心ELISA技术，通过特异性抗原和抗体之间的反应来检测甲型H1N1流感病毒的存在。具体来说，在微孔板上预先包被一种针对甲型H1N1流感病毒的特异性单克隆抗体，当待测样本加入后，如果其中含有目标病毒抗原，则会与包被抗体结合。随后加入另一种酶标抗体，这种抗体同样能特异性识别并结合到目标病毒抗原上，形成“抗原-抗体-酶标抗体”的复合物。最后添加底物溶液，酶催化底物发生显色反应，通过比色分析判断是否存在目标病毒抗原。

关键试剂与材料

1. 包被抗体：需选择高亲和力且特异性强的单克隆抗体作为包被抗体。

2. 酶标抗体：通常采用辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体，确保其能够高效地与目标抗原结合。

3. 底物溶液：常用四甲基联苯胺（TMB）作为底物，它在酶的作用下会产生蓝色产物，便于观察和测量吸光度值。

4. 终止液：一般使用硫酸溶液终止反应，使蓝色转变为黄色，便于后续测定。

实验步骤详解

# 样品处理

首先需要正确采集临床样本，如鼻咽拭子或呼吸道分泌物等，并按照要求妥善保存。样本应在低温条件下运输至实验室，在实验前应充分混匀以保证均匀性。

# 微孔板准备

将预先包被好单克隆抗体的微孔板取出，置于室温平衡至少30分钟。在此期间可以开始准备其他试剂。

# 加样与孵育

向每个微孔中加入适量稀释后的样品以及相应的对照品，每孔体积一致。然后将微孔板密封后置于恒温箱内进行首次孵育，时间设定为37℃±1℃，持续时间为60分钟。

# 洗涤

孵育结束后，倒掉微孔内的液体，用洗涤缓冲液彻底清洗微孔板5次以上，每次都要尽量沥干水分，避免残留影响后续实验结果。

# 加入酶标抗体

再次向每个微孔中加入一定量的酶标抗体工作液，同样要确保每孔加样量相等。然后重新密封微孔板，放入恒温箱内进行第二次孵育，条件同前，时间为37℃±1℃，持续60分钟。

# 再次洗涤

重复上述洗涤过程，确保所有未结合的酶标抗体都被清除干净。

# 显色反应

向每个微孔中加入适量的底物溶液，避光条件下继续孵育，通常时间为10-15分钟。此时应该能看到明显的颜色变化。

# 终止反应

当达到理想的颜色强度时，立即加入终止液停止反应，使颜色从蓝色转变为黄色。

# 数据读取

使用酶标仪测量各孔的吸光度值，通常选择波长450nm作为主波长，630nm作为参考波长。记录下每个样品的OD值，并据此计算出最终的结果。

结果判定

根据标准曲线确定样品中目标病毒抗原的浓度。如果样品的OD值高于临界阈值，则认为阳性；低于此值则为阴性。此外还需考虑阴性和阳性对照的结果是否符合预期，以验证整个检测过程的有效性。

质量控制

为了保证检测结果的准确性，必须严格执行质控措施。包括但不限于定期校准仪器设备、严格控制实验环境条件、使用新鲜配制的标准品和试剂等。同时，还应对实验人员进行专业培训，确保操作规范无误。

综上所述，《DB42/T 790-2012 甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法》不仅提供了详细的实验流程和技术参数，更重要的是强调了各个环节的质量控制要点，这对于提高检测准确率具有重要意义。