TNAIA 0269-2023 牛羊场隐孢子虫病诊断与防控技术规程

在TNAIA 0269-2023《牛羊场隐孢子虫病诊断与防控技术规程》中，有一项重要的更新是关于隐孢子虫病检测方法的选择和应用。相较于旧版标准，新版标准更加强调了实时荧光定量PCR（qPCR）技术在隐孢子虫检测中的优先地位。

实时荧光定量PCR技术的应用方法详解

首先，在样本采集环节，应确保样品的新鲜度和代表性。对于牛羊粪便样本，应在动物排泄后立即收集，并置于无菌容器中，避免外界污染。如果无法即时检测，需将样本保存于-80℃低温环境中。

其次，在核酸提取过程中，选用高效的DNA/RNA提取试剂盒至关重要。操作时要严格遵守无菌操作规程，防止交叉污染。推荐使用磁珠法提取，该方法具有较高的回收率和纯度，能够有效去除抑制物，提高后续扩增效率。

然后，在qPCR反应体系配置上，需根据试剂说明书准确配制。通常包括特异性引物、探针、Master Mix以及模板DNA。引物设计应覆盖隐孢子虫属内保守区域，同时具备良好的特异性和灵敏度。反应条件设定为：预变性95℃ 10分钟；循环步骤为95℃ 15秒，60℃ 60秒，共40个循环。

最后，在结果分析阶段，通过软件绘制熔解曲线来判断扩增产物是否单一。Ct值低于阈值线且熔解曲线峰形尖锐表明阳性结果。此外，还需设置阳性对照和阴性对照以验证实验可靠性。当检测到阳性样本时，建议进一步采用组织病理学检查或免疫组化染色予以确认。

通过以上步骤，可以有效利用实时荧光定量PCR技术对牛羊场内的隐孢子虫感染情况进行精准诊断，从而指导科学合理的防控措施制定与实施。