DB36T 1903-2023 实验动物 小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测方法

DB36/T 1903-2023《实验动物 小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测方法》是江西省地方标准，该标准规定了使用荧光定量PCR技术检测实验小鼠中MHV（小鼠肝炎病毒）的方法。以下是一些关键条款的详细解读：

样品采集与处理

标准指出，样品应从健康状况异常的小鼠或疑似感染的小鼠中采集。通常采集的是肝脏组织样本。样本采集后需立即置于-80℃保存，以防止RNA降解。如果不能及时检测，可以将样本保存在RNA稳定剂中。

RNA提取

RNA提取是荧光定量PCR的关键步骤之一。标准要求使用商业化试剂盒来确保RNA的质量和完整性。提取过程中需要注意避免RNase污染，所有使用的耗材和仪器都应经过无RNA酶处理。

引物和探针设计

引物和探针的设计直接影响检测结果的准确性。标准推荐使用特异性高的引物和探针，这些引物和探针应该能够特异性地识别MHV的保守区域。此外，还需要设计一对内参基因引物用于对照实验，以确保反应体系的有效性。

反应体系建立

荧光定量PCR反应体系包括模板DNA、特异性引物、探针、dNTPs、Mg²⁺以及热启动DNA聚合酶等成分。标准建议采用20μL的反应体积，并根据具体实验条件优化退火温度和循环次数。

扩增程序

标准规定的扩增程序一般为：首先在50°C下孵育2分钟激活UNG酶（如有使用），然后在95°C下变性10分钟；接下来进行40个循环，每个循环包括95°C变性15秒，60°C退火延伸60秒。最后进行溶解曲线分析以确认扩增产物的特异性。

结果判定

检测结果通过Ct值来判断。若样品的Ct值低于阈值且溶解曲线符合预期，则判定为阳性；反之则为阴性。同时，内参基因的Ct值应在设定范围内，否则视为无效实验。

以上内容是对DB36/T 1903-2023标准中关于小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的一些重要条款进行了详细解读。遵循此标准有助于提高检测结果的准确性和可靠性。