DB50T 1298-2022 奇异变形杆菌和普通变形杆菌双重Real-Time PCR检测方法

《DB50/T 1298-2022奇异变形杆菌和普通变形杆菌双重Real-Time PCR检测方法》是一项专门用于快速检测奇异变形杆菌和普通变形杆菌的分子生物学检测标准。以下为该标准的重要条文及其详细解读：

【4.1 样品采集】

此部分规定了样品采集的基本要求，包括使用无菌容器收集样本，确保样本的新鲜度和代表性。采集时需注意避免外界污染，同时标明采集时间与地点，这对于后续实验结果的真实性和可靠性至关重要。

【5.2 引物和探针的设计】

本条款强调引物和探针的设计应基于奇异变形杆菌和普通变形杆菌特异性基因序列。设计过程中要确保引物长度适中（通常为18-25bp），GC含量在40%-60%之间，并且避免引物二聚体形成。探针则需要具有高特异性，通常采用荧光标记技术来提高检测灵敏度。

【6.3 实验条件优化】

这部分内容涉及反应体系的优化，如模板DNA浓度、引物浓度、酶量等参数的选择。例如，建议初始变性温度设为95℃持续10分钟，随后进行40个循环的95℃变性15秒、退火结合温度（Tm值）下延伸30秒。此外还提到熔解曲线分析用于确认扩增产物单一性。

【7.4 结果判定】

根据Ct值判断是否检出目标菌株，当Ct≤35时可判定为阳性；若35＜Ct≤40，则需重复试验以确认；Ct＞40视为阴性。同时要求每个反应管内设置阳性对照、阴性对照及空白对照，以此保证实验结果的有效性。

【附录A 参考文献】

列出了一系列关于Real-Time PCR技术应用于细菌检测的研究成果，这些资料为制定本标准提供了理论依据和支持。

以上是该标准中一些关键条款的具体说明，希望对你理解这项技术有所帮助。