DB22T 3353-2022 猪δ冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增(RPA)法

摘要：本文件规定了猪δ冠状病毒检测的重组酶聚合酶扩增（RPA）法的技术要求、操作步骤和结果判定。本文件适用于猪δ冠状病毒的快速检测与诊断。
Title：Detection of Porcine Deltacoronavirus - Recombinase Polymerase Amplification (RPA) Method
中国标准分类号：B 46
国际标准分类号：65.020

《DB22/T 3353-2022 猪δ冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增(RPA)法》是一项专门用于检测猪δ冠状病毒的规范性文件。该标准规定了使用重组酶聚合酶扩增技术对猪δ冠状病毒进行检测的具体操作流程、实验条件以及结果判定等内容。以下将从几个关键点对该标准的重要内容进行深度解读。

### 样品采集与处理

在样品采集部分，标准强调应从疑似感染动物的鼻腔分泌物、粪便或血液中取样。样本采集后需立即置于冰上并尽快送往实验室进行检测。如果不能及时检测，则需要将样本保存于-70℃以下环境中。对于固体样本如粪便，应先将其加入适量生理盐水制成悬液后再提取核酸。

### 核酸提取

核酸提取是整个检测过程中的核心步骤之一。标准推荐采用商业化试剂盒来完成这一环节，以确保提取效率和纯度。在实际操作过程中需要注意避免污染，所有耗材都必须是一次性的，并且在使用前要经过高压灭菌处理。

### RPA反应体系建立

RPA反应体系主要包括引物设计、酶混合物配置等几个方面。引物的设计直接关系到检测的特异性和灵敏度，因此要求引物长度一般为30-40个碱基，并且G+C含量控制在40%-60%之间。此外，在构建RPA反应体系时还需加入适当的稳定剂和调节剂，以保证反应能够在最佳条件下进行。

### 反应条件设定

根据标准的要求，RPA反应的最佳温度通常设定为37°C至42°C范围内，具体温度取决于所使用的酶种类及其说明书上的建议值。反应时间一般设置为15分钟至60分钟不等，这主要取决于目标DNA片段的大小以及反应体系内的各种成分浓度等因素。

### 结果分析与报告

最后一步是对扩增产物进行分析并作出最终判断。标准指出可以通过凝胶电泳法或者荧光定量PCR仪等方式观察扩增曲线的变化情况来确定是否含有特定病原体的存在。一旦发现阳性信号，则可以初步认定该样本携带猪δ冠状病毒；若无明显扩增曲线出现，则认为样本中不存在此病毒。

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