TCVMA 160-2024 猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法

摘要：本文件规定了猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法的原理、试剂与材料、仪器设备、样品处理、核酸提取、扩增反应体系及条件、结果分析和注意事项。本文件适用于猪链球菌与副猪格拉菌的快速检测与鉴别。
Title：Dual TaqMan Real-Time Fluorescent PCR Detection Method for Swine Streptococcus and Haemophilus Parasuis
中国标准分类号：B46
国际标准分类号：07.100.99

TCVMA 160-2024《猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法》是一项专门用于快速诊断猪链球菌和副猪格拉菌感染的标准。在该标准中，有一项重要的变化是关于内标设置的要求。

在旧版标准中，内标设置较为简单，仅要求使用非特异性序列作为内标来监控整个反应过程是否正常进行。而在新版标准中，对内标的设置提出了更严格的要求，明确规定内标必须来源于实验样本之外，并且需要确保其不会与目标基因产生交叉反应。这一改变主要是为了提高检测结果的准确性，避免因样本中存在的抑制物或其他因素导致假阴性结果的发生。

具体应用时，可以选择一段来源于细菌16S rRNA基因的高度保守区域作为内标序列。首先设计一对特异性引物以及一个探针用于扩增内标序列，在构建质粒模板时将这段内标序列插入到质粒载体中。然后按照标准中的操作步骤制备阳性对照品，并将其加入到每个反应体系中作为内对照。这样可以在每次检测过程中同时监测目标基因和内标的扩增情况，从而有效判断反应条件是否合适以及是否存在抑制因素影响了检测结果。

通过这样的改进措施，可以显著提升猪链球菌和副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法的可靠性和稳定性，为临床诊断提供更加准确的数据支持。