DB33T 2254-2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒 双重荧光定量 RT-PCR 检测方法

DB33/T 2254-2020《猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法》是一项浙江省地方标准，主要用于快速、准确地检测猪场中两种重要的肠道病原体——猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）。以下是该标准中一些关键条文的详细解读：

1. 适用范围

标准适用于猪场环境样本、组织样本以及临床疑似病例样本中PEDV和TGEV的检测。这表明该方法不仅限于实验室条件下的研究用途，还广泛应用于生产一线的疾病监控。

2. 试剂准备

标准要求使用特异性引物和探针对两种病毒分别进行设计，并且需要确保探针标记有荧光报告基团和淬灭基团。例如，FAM标记用于PEDV探针，而VIC标记用于TGEV探针。这一规定保证了双重检测过程中不会出现信号交叉干扰。

3. 样本采集与处理

对于组织样本，需采集病变部位的小肠黏膜，并立即置于含有RNA保护剂的缓冲液中保存；对于粪便样本，则直接取新鲜排泄物并加入裂解液处理。这些步骤旨在最大限度地保持病毒核酸完整性，提高后续检测灵敏度。

4. 反应体系建立

标准指出每个反应体系应包含特定浓度的反转录酶、DNA聚合酶以及优化后的缓冲溶液。此外，还需加入一定量的阳性对照品和阴性对照品以验证实验结果的有效性。通过标准化的操作流程可以有效减少人为误差带来的影响。

5. 扩增条件设置

反应程序通常包括一个逆转录步骤（42°C持续15分钟），随后进入PCR扩增阶段（95°C预变性3分钟后循环40次）。每次循环包括95°C变性15秒和60°C退火延伸60秒两个阶段。这样的温度梯度设置能够最大程度上满足两种病毒基因片段的扩增需求。

6. 结果判定标准

当Ct值小于设定阈值时视为阳性，大于阈值则为阴性。同时要求至少有一条曲线达到设定的基线水平才能确认为有效检测结果。这种严格的结果判定机制有助于提高诊断准确性，避免假阳性和假阴性的发生。

7. 质量控制措施

实验全程必须配备内参基因作为质控指标，用来评估整个RT-PCR过程是否正常运行。如果内参基因未能成功扩增，则需重新检测或调整实验参数。

通过以上分析可以看出，DB33/T 2254-2020不仅提供了详细的检测方法指导，还特别强调了从样本采集到最终结果判定各个环节的质量控制要点，这对于保障检测结果的真实可靠具有重要意义。