DB37T 3997—2020 细菌耐药基因blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术

《DB37/T 3997—2020细菌耐药基因blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术》是一项地方标准，该标准规定了利用环介导等温扩增（LAMP）技术检测细菌耐药基因blaNDM常见亚型的方法。以下是对标准中一些关键条款的详细解读。

范围与术语

标准适用于临床样本中细菌耐药基因blaNDM常见亚型的快速检测。其中术语“环介导等温扩增”是指在恒定温度下使用特异性引物对目标DNA片段进行高效扩增的技术。这一技术无需复杂的仪器设备，适合于基层医疗机构使用。

原理

LAMP技术通过设计针对靶序列不同区域的六条特异性引物，在等温条件下实现对目标基因的特异性扩增。标准指出，blaNDM基因具有高度保守性，因此选用其保守区作为扩增靶点，确保检测结果的准确性。

样品采集与处理

样品应从患者感染部位采集，如血液、尿液或伤口分泌物等。样品处理时需注意无菌操作，避免污染。样品处理后需立即进行DNA提取，推荐使用商品化试剂盒以保证提取效率和纯度。

DNA提取

DNA提取是影响检测灵敏度的关键步骤。标准建议采用磁珠法或其他高效提取方法，确保提取出的DNA浓度不低于10ng/μl，并且A260/A280比值应在1.8-2.0之间。

LAMP反应体系建立

LAMP反应体系包括模板DNA、Bst DNA聚合酶、特异性引物、dNTPs以及反应缓冲液。标准要求每个反应体系的总体积为25μl，其中模板DNA量控制在0.5-1.0μl之间。引物的设计需覆盖靶序列的不同区域，以提高扩增特异性。

扩增条件

LAMP扩增通常在60-65℃条件下进行，时间为40-60分钟。标准强调，扩增结束后需立即终止反应，防止非特异性扩增产物的影响。扩增产物可通过肉眼观察或荧光检测仪检测。

结果判定

阳性结果表现为扩增管内液体颜色变化或荧光信号出现，而阴性对照则保持不变。标准特别指出，若出现非特异性扩增，则需重新设计引物并重复实验。

注意事项

标准提醒操作人员在实验过程中严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。同时，定期校准仪器设备，确保检测结果的可靠性。

通过以上解读可以看出，《DB37/T 3997—2020》为临床实验室提供了科学规范的操作指南，有助于提高细菌耐药基因blaNDM常见亚型的检测水平。