DB32T 3762.3-2020 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序

摘要：本文件规定了新型冠状病毒核酸荧光PCR检测的样本采集、运输、储存、实验室操作、质量控制及结果判定等要求。本文件适用于医疗卫生机构开展新型冠状病毒核酸荧光PCR检测工作。
Title：Technical Specification for Novel Coronavirus Detection - Part 3: Fluorescent PCR Nucleic Acid Detection Procedure
中国标准分类号：C46
国际标准分类号：11.100.99

DB32/T 3762.3-2020《新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序》是一项重要的地方标准，用于指导新型冠状病毒核酸检测的操作流程和技术要求。以下是对该标准中一些关键条款的详细解读。

### 样本采集与保存

标准指出样本采集应在专业人员指导下进行，确保样本质量。样本类型包括咽拭子、鼻咽拭子等，需立即放入含有病毒保存液的采样管中密封，并尽快送检。保存温度一般为-70℃以下，若暂时不能冷冻保存，则应置于4℃短期存放，但不得超过24小时。

### 核酸提取

在核酸提取过程中，建议使用自动化仪器以提高效率和准确性。对于手工提取方法，需严格遵守操作规程，避免交叉污染。提取后的核酸样本浓度应不低于50ng/μl，纯度A260/A280值应在1.8-2.0之间。

### 引物与探针设计

引物和探针的设计至关重要，需针对新冠病毒特异性基因区域（如N基因或ORF1ab基因）进行设计。推荐使用BLAST工具对设计好的序列进行比对，确保无非特异性结合位点。同时，引物长度通常为18-25bp，GC含量控制在40%-60%之间。

### PCR反应体系建立

标准规定了PCR反应体系的基本组成，包括模板DNA、上下游引物、探针、dNTPs、Mg²⁺离子以及热启动酶等成分。反应总体积一般为20μl，其中模板DNA量根据实验优化确定。此外，还特别强调了对照组设置的重要性，至少包含阳性对照、阴性对照及内参对照。

### 扩增条件设定

扩增条件通常包括预变性步骤（95℃ 5分钟），随后进行40个循环的变性（95℃ 15秒）、退火延伸（60℃ 1分钟）。每个循环结束后需记录荧光信号强度，用于后续数据分析。

### 结果判定

结果判定基于Ct值（循环阈值）来判断样本是否呈阳性。一般而言，Ct值小于设定阈值视为阳性，大于阈值则为阴性。当遇到灰区时，需重复实验或采用其他方法确认结果。

### 质量控制

为了保证检测结果的可靠性，标准要求定期进行实验室内部质控和外部质控。内部质控可通过加入已知浓度的标准品来监测系统稳定性；外部质控则需要参加国家或省级组织的室间质评活动。

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