DB37T 2995-2017 副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术

DB37/T 2995-2017 是山东省地方标准，规定了副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测的技术要求。以下是对标准中关键条款的解读：

样品采集与处理

标准指出样品应包括病猪的鼻腔、咽喉或肺组织等部位。采集时需使用无菌容器，并迅速送检。样品处理要求在低温条件下进行，通常使用生理盐水或PBS缓冲液清洗样本，去除杂质后研磨成匀浆。

核酸提取

核酸提取是关键步骤之一。标准推荐使用商品化的DNA提取试剂盒，确保提取效率和纯度。操作过程中需注意避免外源DNA污染，建议设立阴性和阳性对照以验证实验可靠性。

引物与探针设计

引物和探针的设计直接影响检测结果的准确性。标准强调引物长度应在18-25bp之间，GC含量控制在40%-60%范围内。探针则需要标记荧光基团和淬灭基团，保证其特异性与灵敏度。

扩增条件

荧光定量PCR的扩增条件包括预变性、退火延伸及终延伸等阶段。标准给出了推荐的温度和时间参数：预变性95℃ 10分钟；循环次数为40次，每循环包括95℃ 15秒，60℃ 60秒。

结果分析

结果判断依据Ct值确定。标准设定阳性阈值为Ct≤35，当Ct值低于此阈值时视为阳性；若Ct值介于35至40之间，则需重复实验确认；Ct值超过40则判定为阴性。同时，内参基因的稳定表达也是评判实验质量的重要指标。

通过以上解读可以看出，该标准从样本准备到最终结果分析都提出了严格的要求，旨在提高检测的准确性和可重复性，为副猪嗜血杆菌感染的快速诊断提供了科学依据。